circRNA敲除細胞株揭秘其對基因調控的重要作用(干細胞對面部的重要作用)
環狀RNA(circular RNAs, circRNAs)是一類由mRNA 前體(pre-mRNA)經反向剪接形成的共價閉合環狀非編碼RNA。CircRNA最早是在上世紀70年代在病毒中被發現，但是由于早期RNA文庫制備廣泛使用polyA富集的方式（circRNA沒有游離的5’和3’末端），以及RNA-seq讀數要求以線性方式與基因組對齊的計算算法，導致大量circRNA的信息被遺漏，使得人們一度認為環狀 RNA 只是錯誤剪接的副產物，對circRNA的關注并不高。
隨著高通量測序技術和生物信息學的發展，成千上萬種circRNA被發現，圍繞著circRNA的基礎研究也越來越多。大量研究表明circRNA在哺乳動物細胞中具有內生、豐富、保守、穩定等特點，并經常表現出組織或時空特異性，可以通過多種機制參與機體生長發育調控，以及疾病的發生和發展。因此，近年來circRNA逐漸成為非編碼RNA研究領域的熱點。
circRNA與疾病的關系
目前研究最多的是circRNA與實體瘤之間的關系，促進腫瘤生成的一些circRNA，如頭頸部鱗狀細胞癌中的circPvt1；結直腸癌、食道鱗狀細胞癌和肝細胞癌中的cirs-7（CDr1as）。抑制腫瘤的circRNA，如膠質母細胞瘤中的circsMARCA5 和 circ-SHPRH。還有一些circRNA在不同組織或不同細胞所起的作用可能不同，如circHiPK3，在直腸癌中是原癌基因，但是在膀胱癌中又是抑制癌細胞的。
除了癌癥，研究還發現circRNA與糖尿病，心血管疾病，慢性炎癥和神經系統疾病都有密切的關系。相信隨著生物技術的發展以及越來越多對circRNA的深入研究，circRNA的形成和作用機理可以更加清晰，在疾病預防，診斷及治療方面也可以起到重要的作用。
circRNA 的基因編輯與調控，為疾病研究與治療助力！
circRNA涉及許多復雜的功能，那一般是如何對它的功能進行研究的呢？和編碼基因類似，常見的做法是將該circRNA敲除（降）或者進行過表達，下面我們介紹下幾種最常用的circRNA基因編輯與調控。
CRISPR/Cas9技術敲除特定circRNA，揭秘其對腫瘤形成的調控機制
circRNA敲除是指在基因DNA水平進行編輯，達到徹底敲除的目的。最常用的是在circRNA exon的兩端設計2條gRNA，敲除整個環化的外顯子序列。這種方案雖然可以敲除circRNA，但是在敲除circRNA的同時，也會影響到編碼蛋白的親本基因，對于其功能的研究并不太理想。
由于對親本基因影響較大，目前越來越多研究者已經放棄使用這種方案敲除circRNA，比較理想的方法是敲除外顯子側翼內含子中的成環元件，來達到破壞circRNA成環同時又不影響編碼基因表達的目的。但是這種circRNA敲除方案比較難設計，許多初入門者很難掌握設計打靶方案的邏輯。
以circ-HIPK3為例，circ-HIPK3是人體細胞內含量豐富的一種環狀RNA，它可以與多種miRNA結合，作為細胞生長的調節劑，影響腫瘤的形成。為了驗證circ-HIPK3成環的機制，需要找到側翼內含子中的成環元件，對上下游預測的兩個成環元件分別設計一對sgRNA，利用CRISPR/Cas9系統將預測的成環元件進行敲除，檢測circRNA表達情況是否發生變化。經過PCR和RT-QPCR驗證，發現下游成環元件敲除后，circHIPK3表達明顯下調，而上游成環元件敲除后，circHIPK3的表達不僅沒有下調還有所升高。推測可能是上游的成環元件序列太多，預測的不準確。為了進一步驗證是其他成環元件驅動的成環，將gRNA3或gRNA4分別與gRNA5或gRNA6共注射，敲除成環元件上游大片段內含子。RT-QPCR結果顯示circHIPK3表達確實下降了，說明上游是由其他的成環元件起到成環的作用。
源井生物憑借豐富的基因編輯方案設計經驗，對circRNA設計敲除外顯子側翼內含子中的成環元件的方案，來達到破壞circRNA成環同時又不影響編碼基因表達的目的。結合CRISPR-U?高效編輯技術，效率是普通方法的10倍，可以快速篩選出circRNA敲除的陽性克隆。
敲降特定circRNA，揭秘其對細胞增殖和凋亡的調控機制
在研究circRNA功能的方法中，最經典的抑制circRNA的方法是通過RNAi的方式（shRNA）進行敲降。為了避免影響到mRNA，設計方案時需將干擾序列設計在反向剪接位點處。利用siRNA對circ-HIPK3進行干擾，觀察circ-HIPK3敲降后，是否會影響細胞增殖或者凋亡。首先設計三組實驗，分別針對HIPK3 mRNA線性轉錄本、circ-HIPK3環狀轉錄本和兩種轉錄本共有部分設計siRNA，并在HEK-293 T細胞系上驗證設計的siRNA只干擾相應的轉錄本。利用增殖凋亡檢測試劑盒：CCK-8和EdU進行細胞增殖凋亡檢測，結果顯示HIPK3 mRNA敲降后不明顯影響細胞增殖，而circ-HIPK3敲降后，會明顯抑制細胞增殖。
源井生物可通過設計高效的shRNA，用慢病毒法將干擾載體轉入細胞中，根據最佳藥篩濃度對細胞進行藥物篩選，直到對照組細胞全部死亡，獲得circRNA敲降的穩定細胞株。
過表達特定circRNA，揭秘其成環機制
circRNA過表達一直有成環效率低，容易錯配成環等難點。通過優化側翼成環框架，如成環元件、QKI等RBP的結合位點，使circRNA準確高效環化。過表達后仍需要檢測是否成功成環，以及線性mRNA是否表達。為了研究一種新環狀RNA載體表達系統的成環效率，選擇小鼠circRtn4環狀基因在多種細胞系（包括Hela，N2a，HEK293）中進行表達驗證。根據不同細胞系中進行的RT-QPCR實驗數據顯示，新載體系統pCircRNA-DMo-Rtn4成環效率在幾種不同的細胞系中均比普通的載體系統（pCircRNA-BE-Rtn4）要高效得多。
CRISPR-U?高效細胞基因編輯技術
源井生物專注于細胞及微生物基因編輯， CRISPR-U?是源井生物自主研發的細胞基因編輯技術，比普通CRISPR/Cas9技術的基因切割效率更高。利用CRISPR-U? 的技術優勢，源井生物已成功在超過100種細胞系上實現基因編輯。
本文介紹到的circRNA基因編輯相關的服務，源井平臺都可以提供，包括敲除，干擾、過表達以及檢測，歡迎咨詢。
參考文獻：
[1] Kristensen, L. S., Andersen, M. S., Stagsted, L. V., Ebbesen, K. K., Hansen, T. B., & Kjems, J. (2019). The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics, 20(11), 675-691.
[2] Santer, L., B?r, C., & Thum, T. (2019). Circular RNAs, a novel class of functional RNA molecules with therapeutic perspective. Molecular Therapy.
[3] Zheng, Q., Bao, C., Guo, W., Li, S., Chen, J., Chen, B., ... & Liang, L. (2016). Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature communications, 7(1), 1-13.
[4] 劉旭慶，高宇幫，趙良真，蔡宇晨，王匯源，苗苗， 顧連峰，張航曉.環狀RNA的產生、研究方法及功能. Hereditas (Beijing) 2019 年6 月, 41(6): 469 ―485
